生物过程工程开发策略与技术手段，以及生物反应器技术在过去的20年 内伴随着生物医药产业的快速腾飞，以日新月异的速度发展起来，成为当今生物技术产业化开发中的核心支撑技术，也是生物医药生产过程中决定产品质量与成本的 重要因素。以规模化哺乳细胞培养生产病毒疫苗为例，对生物过程工程的研究与开发策略及技术手段，以及细胞培养用生物反应器的发展现状与未来发展趋势作了较 为系统的分析。
1 动物细胞培养技术生产疫苗的发展
2012年11月20日，诺华疫苗公司(Novartis Vaccines)宣布，美国FDA批准其研发的Flucelvax上市，用于18岁及以上成人季节性流感的防治。这是动物细胞培养技术生产疫苗发展历程中的一个里程碑事件。该批准基于一项多国、随机、安慰剂对照、单盲的临床试验，纳入7700名18～49岁成人流感患者，结果表明，Flucelvax防治流感的有效率为83.8%。此外，1700名49～65岁受试者的抗体反应显示，Flucelvax与传统鸡胚培养疫苗Agriflu具有相同效力。Flucelvax是一种在哺乳动物细胞中培养的含有A型及B型流感病毒株的新型流感疫苗，该批准使其成为首个在美国上市的细胞培养的流感疫苗。
在Flucelvax获准上市前，百特疫苗(Baxter Vaccine)公司已于2002年利用VERO细胞通过发酵罐培养法生产的流感疫苗获准进入荷兰使用。2009年，诺华公司己成功利用野生型毒株通过MDCK细胞培养技术生产出甲型H1N1流感疫苗。
近年来，美国政府和世界卫生组织都积极推进使用细胞培养技术替代鸡胚培养技术生产流感疫苗。哺乳细胞具有无外源因子污染、易于规模化生产、抗原稳定等优点，因此利用其培养生产的疫苗具有较好的免疫原性，接种后不良反应轻，较为安全①。细胞培养制备流感疫苗主要使用VERO、MDCK、PER.C6三个细胞系。与传统鸡胚培养相比，哺乳动物细胞培养技术生产流感疫苗的方法更快、更廉价、更高效，有助于人类预防包括禽流感在内的流感的大规模暴发，因此，利用细胞培养技术生产流感疫苗已成为目前流感疫苗研制的重要方向。
2 用于病毒疫苗生产的细胞系的发展
在生物医药生产过程研究中，提高蛋白质表达水平与表达质量的方法主要集中在优化宿主细胞系、研发与改进全合成培养基、开展质量源于设计(QbD)驱动的过程优化技术、过程分析技术(PAT)的应用，以及一次性生物反应器的应用等几个方面。在细胞培养生产病毒疫苗的领域，也有同样的研究发展方向②，其中，宿主细胞是与培养过程成败最相关的问题之一。
2.1 细胞系的研究进展
在流感疫苗的细胞培养生产开发中，贴壁生长的犬MDCK细胞和猴VERO细胞是目前最普遍的选择。同时，人们也在积极驯化能够在全合成无血清培养基中悬浮培养的MDCK、VERO细胞系，以及其他细胞系，如Crucell公司研发的人PER.C6细胞，人HEK293细胞，ProBioGen公司研制的鸭AGE1.CR细胞，Vivalis公司生产的鸭EB66细胞，修饰的MDCK细胞系及VERO细胞系。上述细胞都被成功用于流感疫苗生产的研究或中试，但它们在生物反应器内的表现特征还远没有完全解析。
一般认为，人源的细胞系所复制的病毒(蛋白)更加接近于感染人的野生型病毒，同时多个研究报告也指出由于人源细胞系的糖基化机制与人源蛋白的糖基化一致，所以宿主细胞是决定流感病毒血凝素糖基化结构的关键因素，综上两点认为人源的细胞系更适合于人用疫苗的生产③。最近，德国CEVEC Pharmaceuticals GmbH公司开发了两种来源于人羊水细胞可悬浮培养的人源细胞系CAP细胞，其被转入腺病毒功能基因(E1A、E1B和PIX)，并经过驯化可以在无血清培养基中悬浮生长。其他较为普遍的转化腺病毒E1基因的人细胞系包括源于人胎儿视网膜原代细胞的PER.C6细胞④，以及源自人胚胎肾细胞的HEK293细胞。
2.2 常用细胞系的特点与应用
①VERO细胞：日本学者Yasumura和Kawakita于1962年从正常非洲绿猴肾分离获得的贴壁依赖性细胞系，是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，VERO细胞具有以下特点：来源方便，可连续传代，生长速度快；对多种病毒的感染敏感，病毒增值滴度高；遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性高；培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器中实施大规模培养。
最初流感病毒在VERO细胞中很难实现高效繁殖，但这个问题通过向培养基中反复添加胰酶得到解决。百特(Baxter)公司已经开发了一套VERO细胞疫苗生产平台，目前用于人季节性大流行流感毒株的大规模生产。由于VERO细胞在一定代次内不表现致肿瘤特性，没有病原体和反转录酶活性，且可以在无血清的条件下生长并感染病毒，快速稳定地实现疫苗生产的放大，是目前唯一广泛应用于商业化疫苗生产的细胞系。
目前，获得批准用VERO细胞生产的疫苗有脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、肾综合征出血热疫苗、乙型脑炎疫苗等。另外甲型肝炎、腮腺炎VERO细胞疫苗，腹泻轮状病毒VERO疫苗也在加紧研制当中。
②MDCK细胞：从犬肾获得，其在平板上培养时会合成紧密连接蛋白并分泌到表面球状顶部形成单细胞层。MDCK细胞来源的季节性流感疫苗的临床试验结果表明，此类疫苗的安全性和免疫原性与鸡胚来源的疫苗相当。
全球最大的生物制药公司之一——诺华公司经过驯化获得的MDCK细胞株33016-PF已经可以进行无血清和无微载体的悬浮培养，且已经放大到1000L的规模。利用33016-PF细胞生产的流感疫苗Optaflu已于2007年经欧盟批准上市⑤。2009年，诺华公司又成功利用野生型毒株通过MDCK细胞培养技术生产出甲型H1N1流感疫苗，大大节约了生产时间。
有报道指出，MDCK细胞仅支持人源病毒的复制。因此与其他几种细胞系相比，将MDCK细胞用于疫苗生产具有安全性方面的潜在优势。但相反的是，虽然在生产裂解或亚单位疫苗的过程中已进行了严格的化学裂解和纯化，但用于流感疫苗生产的MDCK细胞系仍具有潜在的致肿瘤特性。
③PER.C6细胞：源自人视网膜的原代细胞，通过插入腺病毒E1基因抑制了PER.C6细胞的衰亡而被永生化，因此能够无限地进行自我复制。荷兰Crucell NV生物医药公司建立的PER.C6标准细胞库已证明没有外源病原和反转录酶活性，符合美国和欧盟管理部门的要求。
由于PER.C6细胞本身的遗传特性，使得这种高活力细胞具有高密度培养、高PCD (picogram/cell/day)和高产量特性，能够在无血清和无动物组分培养系统中以贴壁或悬浮的方式进行培养，并且可容易地从一种培养基中或培养条件下转移至另一种培养基中或培养条件下，已被广泛用于新疫苗、抗体、治疗性蛋白产品的研制中。目前，PER.C6己被批准用于生产用于基因治疗试验的重组腺病毒，及被接受进行-IV疫苗的I/Ⅱ期临床试验。
图1 用于疫苗生产的细胞培养方式的发展历程
3 哺乳细胞培养生物反应器
3.1 国外哺乳细胞培养生物反应器的进展
从 动物细胞大规模培养的发展趋势来看，反应器悬浮培养动物细胞技术、无血清培养技术等是当前世界各大生物公司产业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展方 向，其在大规模疫苗生产中提高单位制品产量、细胞高密度培养及表达、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产的制品质量等方面都起到非常重要的作用， 同时对预防流感的大规模暴发起到积极的作用，是各大生物公司竞相开发的前沿课题。美国FDA和我国SFDA都鼓励和要求各生物公司建立起规模化、自动化的疫苗生产技术平台，从而提高和保证疫苗质量。图1简要描述了动物细胞培养生物反应器的发展历程。
细胞培养生物反应器按细胞培养方式不同分为三类。
①细胞贴壁培养型生物反应器：需要使用微载体，微载体悬浮于反应器的细胞培养液中，细胞贴附在微载体上生长，微载体培养兼有贴壁培养和悬浮培养的优点，主要形式为搅拌式生物反应器、中空纤维生物反应器等。
② 细胞包埋培养型生物反应器：需要使用多孔载体或微囊，细胞被截留在载体中或包埋于微囊中，即可用于悬浮细胞培养，也可用于贴壁细胞的培养，如流化床生物反 应器、固定床生物反应器，其优点在于能最大程度降低搅拌剪切力对细胞的伤害，细胞容易培养生长，但由于生物反应器增大体积后溶氧的供给受到限制，工艺放大 较难。该类反应器在细胞培养生产病毒疫苗中也有一定的应用。
③细胞悬浮培养型生物反应器：适合于杂交瘤细胞、CHO细 胞、昆虫细胞和一些植物细胞等可以悬浮培养的细胞培养，细胞在培养过程中不贴壁，悬浮于培养液中生长，如搅拌式生物反应器、气升式生物反应器等。由于目前 在病毒疫苗的实际生产中所用的细胞系大都是贴壁培养型，所以细胞悬浮培养型生物反应器在疫苗实际生产中应用较少，但随着细胞系的驯化与改进，其应该是未来 的发展方向。
由 于动物细胞无细胞壁，对剪切极端敏感，在细胞生长控制上，需要防止细胞分化和细胞凋亡，无论何种形式的细胞培养反应器都要具备低剪切效应、混合性能好等特 点。同时，还需要细胞形态在线观察和活细胞数量的传感技术、能严格控制反应器的操作条件，以及有关防污染的灌注系统、取样系统等。
目前，全球已有多种生物反应器广泛应用到流感疫苗生产中，瑞士诺华公司利用MDCK33016细胞株生产流感疫苗Optaflu的规模已经超过1000L，美国MedImmune Vaccines公司利用MDCKCCL34细胞株生产流感疫苗FluMist的最大规模为2500L，奥地利Baxter Vaccine公司利用VEROCCL81细胞株生产流感疫苗的生物反应器的规模最大已经达到6000L。图2是Lonza公司报道的其20 000L PER.C6细胞悬浮培养装置。表1进一步总结了国外使用微载体生物反应器生产病毒疫苗的现状。
图2 Lonza公司展示的其20 000L Per.C6细胞悬浮培养反应器
细 胞悬浮培养型是生物反应器细胞规模培养的最理想选择，但是由于以不锈钢为主要材质的刚性生物反应器还存在一些问题，包括一次性投资巨大、建设周期长、设备 保养费用高、需要不断灭菌与清洗、操作灵活性差等，国外在规模化细胞培养领域已发展为广泛使用一次性细胞培养反应器的阶段，反应器体积已达到吨级。一次性 生物反应器的显著优点包括：可以降低一次性资本投入最大达到70%、批次生产规模可以随疫情(市场需求)和培养滴度的提高(技术进步)做调节、省去了灭菌清洗的操作费用与时间、显著降低了污染来源、提高生产效率(图3)。
表1 国外反应器微载体培养生产疫苗现状®
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公司 |
产品 |
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Baxter |
流感(6000L体积)、天花 |
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Baxter |
甲肝(VERO细胞100L体积灌注培养模式连续培养200d) |
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Nederlands Vaccin Instituut (NVI) |
灭活脊髓灰质炎病毒 |
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Aventis |
乙型脑炎病毒(2000L体积) |
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GSK |
脊髓灰质炎病毒(VERO细胞) |
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Solvay Pharmaceuticals (Netherlands) |
流感疫苗(MDCK细胞)
3.2 我国哺乳细胞培养生物反应器的发展现状
国 内生产的主要刚性结构生物反应器包括：成都英德生物医药装备技术有限公司研制的磁悬浮搅拌式生物反应器、杭州安普生物工程有限公司研制的激流灌注式生物反 应器、北京天和瑞公司研制的常规动物细胞反应器等。这些反应器都已进入一定的规模化生产阶段，其中成都英德生物的细胞生物反应器和辅助装置在中国血液制品 领域占90%以上的市场份额，在疫苗生产领域占35%的市场份额。但是，国产生物反应器无论在品质、品种或规模上，与国际上的主要生产商(如Sartorius、GE、Simens、NBS、Applikon等)的产品相比，还有明显的差距，最关键的是我国的疫苗生产企业对国产核心设备缺乏信心，而且国内尚无一次性生物反应器的批量生产能力。
目前，我国生产人用疫苗的哺乳细胞培养主要有：培养VERO细胞(非洲绿猴肾细胞)用于乙型脑炎、出血热、甲型肝炎、狂犬病疫苗的生产；培养地鼠肾细胞用于乙型脑炎、狂犬病疫苗的生产；培养CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)用于重组乙型肝炎疫苗的生产；培养兔肾细胞用于风疹疫苗的生产等。但是，我国规模化动物细胞培养生产疫苗的技术相对于西方国家较为落后，表现在硬件上的细胞反应器和关键辅助设备，软件上的过程生产工艺与控制、质量保证体系、细胞培养基和生产细胞系等。
在我国，动物细胞培养生产疫苗工艺过程中，大部分疫苗生产企业还在采用转瓶培养动物细胞，因此，细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。
利 用生物反应器生产疫苗等生物制品，可以大幅度提高规模化动物细胞培养的单位产量，实现细胞的高密度培养、高密度表达，同时保证大规模生产的产品质量，是生 物制药技术的发展方向。我国应该在此领域加大国家投入，集中国内优势单位的力量协同攻关，研发生产规模化的细胞培养生物反应器核心装置，建立符合GMP标准的模块化生产车间设计能力；开展符合cGMP要求的、完备的验证工作(贯穿从反应器装置设计到生产工艺验证的整个过程)，全方位地迎头赶上发达国家的技术发展进程。
图3 国外几种主要的细胞培养用一次性生物反应器
4 已商业化的新型细胞培养装置
4.1 中空纤维式生物反应器
中空纤维式生物反应器(hollowfiber bioreactor，HFB)于1972年由Richard Knazek首先提出。该反应器的突出特点是通过连续的新鲜培养基供应和废物的排除，可以实现较高细胞密度的培养，一般可以达到1×108细胞/mL。HFB在细胞培养生产病毒的过程具有其他形式反应器所不能实现的优点。
①可以在生理密度下(1×108细胞/mL)培养贴壁或不贴壁生长细胞，并可持续较长的时间(数月)。
②连续灌注培养基可以保证类似于细胞在体内环境下的细胞正常功能和相互作用，进而实现较多的病毒感染循环次数。
③避免培养液内代谢毒素的积累，有利于细胞的生长。及时去除有害的细胞因子和病毒编码的宿主shutoff蛋白，避免过早的细胞凋亡。
④病毒可以限制在一个相对较小的范围内，适合于BSL-2和BSL-1环境。
目前有多个品牌、不同尺寸的HFB柱子供应，如FiberCell Systems、CellMax、Zymax、BioVest的PrimerHFTM及AutovaxD等已商业化的HFB反应器系统。但HFB也有明显的缺点，如单个反应器单元放大困难，所以该类反应器目前主要用于实验室和中试规模(图4)。
4.2 ATMI LifeSciences的iCELLisTM纤维载体的固定床反应器
图4 中空纤维生物反应器的结构示意
ATMI LifeSciences的iCELLisTM纤维载体的固定床反应器是世界上第一个完全一体化的高细胞密度生物反应器，反应器为一次性使用。微载体为医用级的聚酯微纤维(polyestermicrofibers)，纤维载体比表面积非常高，相对于传统的STR反应器，在同样的细胞数量基础上，其可以显著降低VERO细胞培养体积20倍以上。该反应器的操作极为简单，避免了使用微载体颗粒的STR反应器细胞培养过程中的一些耗时操作，如繁琐的手工操作、设备灭菌消毒、微载体的处理、从种子培养到大培养的微载颗粒间的细胞转接等。由于细胞在固定床生长，iCELLis生物反应器可以在较低的细胞浓度下接种，省去了传统的逐级预培养过程，如6个滚动瓶培养(1750cm2)就足够用于接种iCELLis1000生物反应器(55L)。培养基在反应器内的均匀分布由磁力搅拌装置实现，这种搅拌模式可以有效减小剪切力对细胞的机械伤害，因此培养过程中的活细胞比例较STR反应器高。培养基由反应器底部运动到顶部，然后再以薄膜的形式由反应器的外壁落下，过程中实现氧气传递，这种传氧方式保证反应器内的总KLa始终保持较高的水平。这种独特的“瀑布”式传氧策略，加之温和的搅拌和高比表面积的细胞固定床，使得iCELLis反应器系统可以获得非常高的细胞数量，相对于STR微载体反应器，其体积效率提高了20倍以上(表2)。同时，由于采用一次性固定床反应系统，在细胞培养的最后，无需离心分离细胞，进一步简化了下游纯化工艺。iCELLis反应器系统的固定床结构及最大规模的反应器iCELLis 1000的集成结构如图5、图6所示。
图5 iCELLis细胞培养反应器系统的固定床结构图
图6 最大规模的反应器iCELLis 1000/500的集成结构图
表2 iCELLis固定床细胞培养反应器验证研究结果
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细胞系 |
产品 |
细胞密度(×l06) |
培养体积的降低倍数 |
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VERO无血清培养 |
流感疫苗 |
28 |
30% |
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VERO |
小儿麻痹疫苗 |
75～150(最大) |
22～28倍 |
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VERO无血清培养 |
小儿麻痹疫苗 |
75～150(最大) |
20倍 |
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MDBK |
BHV |
60 |
20倍 |
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CHO无血清培养 |
MAb |
100～250 |
30%～80%
4.3 一次性细胞培养袋
一次性细胞培养袋(wave bag)是十几年前由Wave bioreactor公司(现在属于GE Healthcare)引入的一种独特的一次性细胞培养反应器。为了实现大规模的悬浮细胞培养，可以平行实施多数量的该种形式的反应器(multiple bag-type bioreactors)，如德国Sartorious的BIOSTAT CultiBag，荷兰Applikon公司的AppliFlex，CELLution Biotech公司的CELL-tainer、MetBio，ATMI公司的Optimaand OrbiCell培养袋、Nucleo生物反应器以及Tsunami反应器等。这种反应器的主体是一次性使用的袋子，由机械传动装置实现培养液在袋内的混合并确保养分的传递。虽然这种形式的生物反应器通过平行培养的方式用于规模化生产，但其局限于非贴壁生长的细胞的悬浮培养，或使用微载体对贴壁型细胞进行培养。
目前，一次性生物反应器的规模可达吨级，形式也拓展到STR的形式。其已成为动物细胞培养技术的发展趋势之一，图7总结了其发展历程。
4.4 微流体培养系统
微流体装置也被称为微型生物反应器(Microbioreactor)，如CellASCIS公司开发的ONIX微流体灌注细胞培养系统，Hurel公司研制的HurelFlow微流控生物反应器，SmartBiosystems公司生产的IVFLAB-6微流体细胞培养系统，以及美国Bioprocessors公司研发的SimCellTM微型生物反应器系统。这些基于微流控的微型生物反应器系统可以高通量地开展细胞培养过程的优化研究和细胞克隆的筛选与评价⑩，可以显著提高细胞克隆筛选与驯化过程效率以及生产过程优化的研究工作效率。
如SimCell高通量细胞培养系统由4个相对独立的模块组成：①5个培养箱模块解决反应器的温控和混合搅拌；②传感器模块提供非接触式pH、溶氧(DO)浓度和细胞数量参数的测量；③取样模块提供从每个反应器内取样并转移到96孔标准酶标板，用于离线参数的分析；④加液模块提供向每个反应器内接种，实施培养液的pH控制、流加营养物成分等操作，可同时滴加8种液体溶液；⑤第5个模块是机器人系统，它将上述4个模块连接起来以实现全自动操作。SimCell的微反应器工作体积为300～800μL，开展平行培养的最大细胞克隆通量可达1 260个/批次。图8是该系统微型生物反应器、系统操作模块的简要示意图。应用微型的、高通量的生物反应器开展细胞培养的过程工程研究，是生物医药过程工程研究技术的发展方向之一。
图7 一次性细胞培养生物反应器的发展历程
5 现代细胞培养过程的放大策略
在现代以生物医药为目的的细胞培养过程的放大技术已不再是一个特别令人关注的问题，这主要来自两个方面：①分子生物学的进步使得以动物细胞为宿主细胞表达原核蛋白的水平快速提升，如CHO细胞表达人源化治疗性抗体的水平目前已达到3g/L以上，甚至10g/L，所以单培养批次的产量与收率与培养体积的关联度下降；②一次性细胞培养反应器的体积已超过1000L。
但是，基于刚性STR反 应器的悬浮细胞培养过程的放大，依然是决定这种细胞培养过程开发成败的关键问题之一，尤其是对基于微载体的动物细胞培养过程放大。这主要由于它是一个多相 的生物过程，不同规模反应器内的流体力学特征的变化、气泡大小与分布、液位压力差和搅拌产生的剪切力等都会影响细胞在反应器内的特征，进而影响细胞生长、 产品生成和产品的质量，因此悬浮细胞培养和微载体细胞在STR反应器内培养规模的放大，在工程开发上仍然是一个极具挑战的任务。
根据生物医药的高附加值、高培养成本、产品研发周期长、新产品品种多(高通量)的特点，不同于传统的逐级放大过程(scale up)，目前国际上细胞培养的放大过程主要是开展过程缩小(scale down)模型的建立。其基本原则是：
①首先通过FEMA、Pareto图的分析，以及DoE明确细胞培养的关键质量相关的过程参数(生化、物理、传质、生长动力学和流体力学等)，建立培养过程的特征空间。
②然后通过DoE和MVA分析，确定这些参数的所谓操作范围，建立所谓的设计空间。
图8 美国Bioprocessors公司的SinCell系统工作原理(a)、生物反应器结构(b)及模块集成(c)®
图9 在建立过程放大与过程缩小模型中三种过程参数空间的关系图
③最后在不同规模的细胞培养反应器间基于等价传氧系数(KLa)、等价总能量输入、相似反应器尺寸比例等原则，经过中试，放大到生产规模，建立可操作与控制的实际操作空间。上述模式中各步骤的关系如图9所示。
所谓scale down模型，就是通过对类似细胞和类似产品的细胞培养过程的科学、深入的理解，建立可靠的设计空间，从而建立成功的、以产品质量和过程稳定性为核心指标的培养规模放大模式(模型)，用于指导未来同类细胞培养过程的放大。其价值在于政府管理部门(如FDA)认可通过高通量的、小规模培养的细胞培养过程所获得的过程数据，可以模拟在cGMP环境下的工业规模生产数据，从而起到加速产品开发、降低开发费用的作用。
6 悬浮动物细胞培养的过程优化策略与可执行方案
首先明确定义科学问题，并收集基础数据，开展DoE试验设计，在反应器、细胞、蛋白质和DNA多 个层次上对哺乳细胞的培养过程建立科学的理解，并提出优化控制方案；然后对所建立的优化控制方案进行验证；最后对优化策略在工业规模的细胞培养过程中的应 用，建立可执行的控制策略和保障措施。这个过程是一个循环的执行过程，通过数次的循环执行上述五个步骤，最终建立可靠的以质量为终极目标的优化细胞培养生 产病毒疫苗的过程(图10)。
虽然基于CHO细胞的培养生产治疗性抗体的过程优化所发展起来的QbD驱动的过程优化策略已相当成熟，但是细胞培养生产病毒疫苗的过程与CHO细胞培养有诸多明显的不同，因此对于细胞培养生产病毒疫苗的过程优化策略必须有其独特性。
开展细胞培养过程优化的第一个技术难点是对细胞在反应器内的悬浮培养过程特征进行系统的研究。需要解决的问题包括：
①通过高通量的细胞培养技术，驯化和筛选到最适合在工业规模的生物反应器内培养的细胞克隆，并确定最适合的培养基。
图10 建立项目过程优化策略的总体技术路线
②根据目前可以在线和离线测量和分析的过程物理、化学、生物化学和细胞生物学参数组，建立基本细胞培养过程多变元参数数据库，开展多变元分析，建立可靠的稳定培养过程的MVA批式模型，进而可以定量地定义“稳定培养过程”的基础数据。
③结合基础数据的MVA分析，开展FEMA分析，确定关键过程参数(critical process attributes, CPA)。
④同时开展系列DoE确定关键质量相关参数(critical qualityattributes，CQA)，并初步明确CQA的可操作空间。
需要解决的第二个关键问题是在明确了CPA和CQA的基础上，确定细胞培养过程优化的“过程设计空间”。相对应的技术难点是建立适合细胞悬浮培养的微型(l00mL≤培养体积≤500mL)平行细胞培养反应器，用于细胞悬浮平行培养。通过系列DoE培养实验确定多参数的、以稳定产品质量为导向的“过程设计空间”。
参考文献：
①Tree J A，Richardson C, Fooks A R, et al. Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains. Vaccine, 2001,19(25-26)：3444-3450.
②Genzel Y, Behrendt I, Rödig J，et al. CAP, a new human suspension cell line for influenza virus production. Appl Microbiol Biotechnol, 20l3,97(1)：111-122.
③Zhirnov O P, Vorobjeva I V, Saphonova O A，et al. Structural and evolutionary characteristics of HA, NA, NS and M genes of clinical influenza A/H3N2 viruses passaged in human and canine cells. Journal of Clinical Virology, 2009,45(4)：322-333.
④Fallaux F J, Bout A, van der Velde I, et al. New helper cells and matched early region l-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Human Gene Therapy, 1998,9(13)：1909-1917.
⑤Reisinger K S, Block S L, Izu A, et al. Subunit influenza vaccines produced from cell culture or m embryonated chicken eggs：comparison of safety, reactogenicity, and immunogenicity. The Journal of Infectious Diseases, 2009，200(6)：849-857.
⑥Levine H L. Vaccine manufacturing facilities of the future. Presented at Vaccines Europe, Dec 1-2, London, England, 2010.
⑦de Vocht M. Intensification of a PER. C6®-based recombinant Ad35 manufacturing process to prepare for commercial scale production. Fifth Annual Optimising Biomanufacturing Processes，Brussels, Belgium, 2008.
⑧张韧，王建超，陈文庆，等.反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产中的应用.中国兽药杂志，2012.
⑨http://www.atmi.com/lifesciences/products/
⑩Long Q，Liu X，Yang Y, et al. The development and application of high throughput cultivation technology in bioprocess development. Journal of Biotechnology, 2014,192，Part B，323-338.
⑾http://www.iclickmedia.com/bioprocessors/simcell_science_sub_page.htm
